永生化人腦微血管內皮細胞的培養步驟！

一．細胞簡介：
細胞名稱：永生化人腦微血管內皮細胞hcmec/d3（str鑒定）
人腦微血管內皮細胞是人微血管內皮細胞通過含端粒酶逆轉錄sv40t慢病毒轉染得到。
二．細胞特性
1）來源：人腦微血管
2）形態：細胞呈梭狀，細長型貼壁生長
3）含量：>1x106細胞數
4）規格：t25瓶或者1ml凍存管包裝
5)用途：僅供科研使用。
三．細胞的培養步驟：
培養基及培養凍存條件準備：
1）準備內皮細胞培養體系包含：
內皮細胞培養基礎培養基 93%
優質胎牛血清（fbs） 5%
內皮細胞培養添加劑 1%
青霉素/鏈霉素， p/s1%
2）培養條件：氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。溫度：37攝氏度，培養箱濕度為70%-80%。
3）凍存液：90%血清，10%dmso，現用現配。
四．細胞處理：
1）凍存細胞的復蘇：
將含有1ml細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入到含4-6ml完全培養基的離心管中混合均勻。在1000rpm條件下離心3-5min，棄去上清液，完全培養基重懸細胞。然后將細胞懸液加入含6-8ml完全培養基的培養瓶（或皿）中37℃培養過夜。第二天顯微鏡下觀察細胞生長情況和細胞密度。
2）細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養。
五．貼壁細胞傳代可以參考以下方法：
1.棄去培養上清，用不含鈣、鎂離子的pbs潤洗細胞1-2次。
2.加入0.25％（w/v）胰蛋白酶-0.53mmedta于培養瓶中（t25瓶1-2ml，t75瓶2-3ml），置于37℃培養箱中消化1-2分鐘（難消化的細胞可以適當延長消化時間），然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養瓶后加入3-4ml含10%fbs的培養基來終止消化。
3.輕輕打勻后吸出，在1000rpm條件下離心3-5min，棄去上清液，補加1-2ml培養液后吹勻。將細胞懸液按1：2的比例分到新t25瓶中，添加6-8ml按照說明書要求配置的新的完全培養基以保持細胞的生長活力，后續傳代根據實際情況按1:2~1:5的比例進行。
3）細胞凍存:收到細胞后建議在培養前3代時凍存一批細胞種子以備后續實驗使用。
六．運輸和保存
干冰運輸及復蘇好存活細胞
（1）1ml凍存管包裝干冰運輸，收到后-80度冰箱保存過夜后轉入液氮或直接復蘇，若發現干冰已揮發干凈、凍存管瓶蓋脫落、破損及細胞有污染，請立即與我們聯系。
（2）t25瓶復蘇的存活細胞常溫發貨，收到后按照細胞接收后的處理方法操作。
七．細胞接收后的處理
1）收到細胞后，75%酒精消毒瓶壁將t25瓶置于37℃培養箱放置約2-3h，若發現培養瓶破損、有液溢出及細胞有污染，請拍照后及時聯系我們。
2）請在4或5x顯微鏡下確認細胞狀態，同時給剛收到的細胞拍照（10×，20×）各2-3張以及培養瓶外觀照片一張留存，作為時收到時細胞狀態的依據。
3）貼壁細胞：細胞在37℃培養箱中放置2-3h，顯微鏡下觀察細胞的生長和貼壁情況，有些貼壁細胞在快遞運送過程中會因振動脫落和脫落后成團的情況。若鏡下觀察細胞的生長密度若在60%以下，可去除培養瓶中灌液培養基（若有未貼壁的細胞需要離心回收，重懸打入到原培養瓶中）,加入新配制的完全培養基6-8ml，放到細胞培養箱中繼續培養。若細胞生長密度達70%-80%以上，可以對細胞進行傳代處理。傳代過程中，若因運輸振動脫落的細胞需要離心回收。
4）備注：運輸用的培養基（灌液培養基）不能再用來培養細胞，請換用按照說明書細胞培養條件新配制的完全培養基來培養細胞。收到細胞后第一次傳代建議t25培養瓶1：2傳代。