原位雜交檢測-武漢思特進科技公司

雜交技術(shù)*重要的因素之一是選擇*適的雜交反應(yīng)溫度。若反應(yīng)溫度低于tm 10～15℃，堿基順序高度同源的互補鏈可形成穩(wěn)定的雙鏈，錯配對減少。若反應(yīng)溫度再低（tm-30℃），雖然互補鏈之間也可形成穩(wěn)定的雙鏈，但互補堿基配對減少，錯配對增多、氫鍵結(jié)合的更弱。如兩個同源性在50%左右或更低些的dna，調(diào)整雜交溫度可使它們之間的雜交率變化10倍，因此在實驗前必須首先確定雜交溫度。通常有三種溫度可供試驗，即*適復(fù)性溫度、苛刻復(fù)性溫度及非苛刻復(fù)性溫度。溫度的選擇及溫度對雜交的影響見表18-3。
*適復(fù)性溫度（optimunm renaturation temperature， tor）：tor =tm –25℃
苛刻復(fù)性溫度：ts = tm – (10或15℃)
非苛刻復(fù)性溫度：tns =tm – (30或35℃)
使用分支dna信號擴增的rna fish
invitrogen? viewrna?和primeflow?檢測是使用分支dna信號擴增 (bdna) 來檢測特異性信號的直接熒光rna ish方法。 使用*但兼容的信號擴增系統(tǒng)讓rna靶標(biāo)的多重復(fù)用成為可能。 熒光rna原位雜交檢測分為四個主要步驟：樣本制備、靶標(biāo)雜交、信號擴增以及檢測。 該方法可實現(xiàn)更高的特異性，更低的背景值和更高的信噪比。
在條件都得到滿足的情況下，雜交的成敗就取決于保溫時間。時間短了，雜交反應(yīng)不完成；時間長了也無益，會引起非特異結(jié)合增多。一般雜交反應(yīng)要進行20h左右。1966年britten和kohne推薦用cot =值來計算雜交反應(yīng)時間。cot 值實際上是雜交液中單鏈起始濃度（co）和 反應(yīng)時間（t）的乘積。實驗表明cot =100時，雜交反應(yīng)基本完成。cot=0，原位雜交檢測，基本上沒有雜交。例如在液相雜交中未標(biāo)記的dna 400μg/ml（按單股dna每微克 紫外吸收值為0.024計算，總的吸收值為 9.6），如果反應(yīng)時間為21h，那么對于未標(biāo)記的dna來說，cot =9.6/21 =100.8，雜交完成了。對標(biāo)記dn a（濃度為0.1μg/ml）來說cot值為0.05，這就充分排除了標(biāo)記dna的自我復(fù)性。tm值25℃時雜交*佳，所以首先要根據(jù)公式（4）計算雜交體tm 值。由此式可見，通過調(diào)節(jié)鹽濃度、甲酰胺濃度和雜交溫度來控制所需的嚴格性。
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