RNA免疫沉淀RIP實驗

rip（rna binding protein immunoprecipitation, rna結合蛋白免疫沉淀）是研究體內 rna 與蛋白結合情況的技術，主要包括rip-qpcr和rip-seq兩種；其中rip-qpcr用來驗證與目標蛋白結合的已知rna，rip-seq用來篩選與目標蛋白結合的未知rna。
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rna免疫沉淀rip實驗原理
細胞裂解后，孵育結合了抗體的珠子，誘餌蛋白通過其抗體結合到beads上，同時和誘餌蛋白互作的rna，也一起沉淀到beads上。洗滌掉未結合的rna后，再用洗脫液將rna-蛋白復合物從beads洗脫下來，便得到rna免疫沉淀產物。rip產物既可用qpcr檢測已知rna，也可以二代測序檢測未知rna。
當沒有合適的誘餌蛋白抗體時，可以通過表達融合了flag標簽的誘餌蛋白，利用flag標簽做免疫沉淀。即細胞過表達flag-bait，經裂解后與anti-flag珠子孵育，誘餌融合蛋白與beads結合，與誘餌融合蛋白互作的rna“共沉淀”到beads上，再經洗滌、洗脫后做qpcr或ngs測序。
rna免疫沉淀rip實驗流程
rip實驗，rna結合蛋白免疫共沉淀，rip-seq檢測實驗.jpg
帶標簽的rna免疫共沉淀流程圖：
rip-qpcr，rip技術實驗，rip實驗外包.jpg
應用領域
coip技術服務.bmp
rip技術應用背景
rna結合蛋白（rna binding protein，rbp）是一類功能強大而廣泛的調節因子，約占細胞編碼的所有蛋白的5%~10%。目前除了少數rna以核酶形式單獨發揮功能，大部分rna通過與蛋白結合形成rna-蛋白復合物來發揮作用。
一方面，rbp參與rna合成、可變剪接、修飾、轉運、翻譯及胞內定位等多個轉錄后調控過程，調控mrna穩定性、lncrna活性、mirna沉默復合體形成等生物學過程；另一方面，rna也會調節這些蛋白質的活性、定位或與其他蛋白質的相互作用，從而影響rbp介導的各種細胞事件。rna與蛋白質的相互作用對于維持細胞穩態是非常重要的，干擾這種相互作用將會導致細胞功能失調和相關疾病的發生。
目前研究rna-蛋白質相互作用的方法分為兩大類：一是以感興趣的rna為中心，尋找與該rna結合的蛋白質；二是以感興趣的蛋白質為中心，尋找與該蛋白質結合的rna。rip（rna免疫共沉淀）屬于后者，利用特異性的抗體捕獲樣本中的目標蛋白，那么與目標蛋白結合的rna也一并被捕獲，之后通過qpcr或者測序技術來確定這些結合的rna。
rna免疫共沉淀rip實驗—客戶案例
rip（rna免疫共沉淀）研究案例.png
lncrna part1通過plzf介導的ezh2募集導致pdgfb表觀遺傳沉默來抑制侵襲性胃癌
研究背景
目前的研究顯示，一種長鏈非編碼rna(lncrna)“part1”在某些癌癥中有抑癌作用，在某些癌癥中又有致癌作用。人類胃癌組織的geo芯片數據顯示，lncrna part1在胃癌中顯著下調，tcga數據庫和gepia數據酷信吸顯示低水平的lncrna part1更容易導致腫瘤轉移和患者生存期縮短；但其臨床意義和潛在機制尚未明確。
研究路線
細胞、cam和小鼠實驗均表明part1水平與胃癌的惡性程度、轉移能力呈負相關
rna-seq實驗發現高表達的part1下調了pi3k-akt通路的一些基因，上調了腫瘤抑制基因plzf，腫瘤組織檢測和tcga數據庫資料確定了該結果
rna pull-down結合質譜鑒走技術首次發現了part1的潛在結合蛋白——ar(已有研究表明ar可以激活前列腺瘟中的plzf并抑制其增殖
rna pull down wb和 rip qpcr實驗確定了part1與ar的相互作用
chip和雙熒光素酶實驗表明ar與plzf啟動子的2個位點結合，plzf啟動子因ar、part1的單獨作用或兩者的協同作用而激活
數據庫調查和co-ip結果均顯示pizf蛋白與ezh2蛋白結合
chip-qpcr結果表明pi3k-akt通路蛋白pdgfb的啟動子與pizf、ezh2蛋白結合、且該區域發生h3k27me3修飾
功能回復實驗表明， pdgfb過表達可以部分回復part1對gc細胞生長、遷移和侵襲、等能力的抑制
研究結論
lncrna part1是胃癌的腫瘤抑制因子，可以作為gc轉移和預后的預測因子。新發現的part1作用機制是：part1與ar相互作用，以雄激素非依賴性的模式激活腫瘤抑制因子plzf，之后plzf蛋白和ezh2蛋白相互作用，導致pi3k-akt通路基因pdgfb的啟動子發生h3k27me3修飾，從而使促癌基因pdgfb的轉錄活性受到抑制。
客戶文獻
han h. et al: long noncoding rna part1 restrains aggressive gastric cancer through the epigenetic silencing of pdgfb via the plzf-mediated recruitment of ezh2. oncogene. 2020. (if=9.867)